Cette ruelle qui se rendait autrefois jusqu'à la rue du Parloir est nommée ainsi parce qu'elle conduisait au monastère des Ursulines, établi sur ce site depuis 1642. Les Ursulines sont des religieuses appartenant à l'ordre de Sainte-Ursule, fondé par sainte Angèle Merici. Cet ordre est la principale des 21 congrégations d'ursulines existantes. Devenu ordre cloîtré en 1620, l'ordre de Sainte-Ursule est regroupé en Ursulines de l'Union romaine après 1900. Ses membres sont des moniales à vœux solennels, vouées à l'enseignement. C'est en 1639 que débarquent en Nouvelle-France la fondatrice séculière des Ursulines de Québec, madame de La Peltrie (voir Hélène-Boullé), la première supérieure, Marie de l'Incarnation, et deux autres ursulines. Les femmes s'installent dans une maison de la place Royale avant de s'établir sur le site actuel du monastère en 1642. Par deux fois, le feu détruira leur logis : d'abord en 1650 puis en 1686. Les ursulines poursuivent encore aujourd'hui leur mission d'enseignement. À l'origine, la ruelle des Ursulines était un sentier que les vaches empruntaient pour se rendre des étables du monastère à l'esplanade où les animaux allaient paître à l'époque du Régime français. Plus tard, la ruelle donnera accès aux écuries situées à l'arrière des maisons des rues D'Auteuil, Sainte-Ursule et Saint-Louis.

Ancien toponyme
Le tracé de la ruelle des Ursulines apparaît sur une carte de 1791, mais aucun nom n'y est inscrit. Sur une carte de 1842, la ruelle porte le nom de Sainte-Ursule Lane. L'appellation de ruelle des Ursulines apparaît pour la première fois sur une carte de 1854.